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单细胞基因表达入门之实验规划指南

发稿时间:2019-09-12来源:ca88会员登录入口生物


为什么要进行单细胞基因表达分析?

跳出传统的基因表达分析,逐个细胞地表征细胞群体,细胞类型和细胞状态等信息

过去,各种生物体、组织和疾病状态中的基因表达差异已经可以利用多种方法来鉴定,比如芯片和大量细胞的RNA测序(RNA-seq)。这些方法通常需要数百至数百万个细胞作为起始材料,但是只能得到整个细胞群体的平均信息。发育生物学、癌症、神经科学、免疫学和传染病中的复杂生物学过程往往涉及到多个单细胞,它们具有不同的细胞命运、状态和功能。对于这些动态的细胞事件,大量细胞的检测只能提供有限的信息,因为单个细胞的信息已经淹没在其中(Griffiths J.A. et al, Mol Syst Biol, 2018)(图1)。


最近,单细胞转录组技术,包括我们的高通量Chromium单细胞基因表达解决方案(Chromium Single Cell Gene Expression Solution),能够在单细胞水平上直接测定基因表达,从而定量细胞内的群体异质性,并逐个鉴定细胞类型、细胞状态和动态细胞跃迁。除了有望鉴定新的细胞亚型和稀有细胞群体,单细胞技术还能更好地了解转录动态和基因调控关系
尽管在单细胞RNA-seq和大量细胞表达实验中,每个样本所测序的转录本数目是相似的,但单细胞基因表达研究可以让您从传统的整体标志物基因分析延伸到细胞类型或细胞状态的鉴定以及伴随的调控通路中动态变化的鉴定,这是由多个基因驱动的。重要的是,单细胞基因表达还能实现细胞群体的无偏向鉴定,而不需要细胞亚型或细胞标志物的任何先验知识。为了充分利用单细胞转录组技术所带来的丰富知识,您在第一次开始实验之前应当考虑有关实验设计、样本制备和下游数据分析的一些相关步骤。本指南将帮助您开展单细胞基因表达实验,并充当路线图,帮助您设计实验,优化实验参数,并确定计算/分析工具,以便更好地分析您的单细胞基因表达数据。

准备单细胞基因表达实验

需要考虑哪些因素?

Step1

我想回答哪些科学问题?

单细胞基因表达分析可以为许多不同类型的研究问题提供答案。这些问题包括但不限于:
A. 我想表征、鉴定、绘制或登记组织或器官中的混合细胞群体


B. 我想表征或鉴定复杂细胞过程中所涉及的新颖生物标志物或调控通路


C. 我想表征或鉴定复杂细胞过程中所涉及的新颖细胞类型或状态

Step2

制备和处理样本的最佳做法是什么?

A. 样本类型 & 制备

关键是您要获得分离良好的细胞悬液、无细胞碎片、极少细胞团块,且细胞活力高(>70%)。了解您所研究细胞的大小范围也很重要。细胞大小通常与细胞表达的转录本数量有关。各种尺寸不同的细胞(直径高达>30 μm)均可与我们基因表达解决方案中使用的Chromium单细胞芯片兼容。

一般来说,细胞制备方案将根据组织来源和细胞类型而变化。每种组织类型都是独特的,因此,必须在开始任何单细胞实验之前优化样本制备(最佳的样本制备指南详见:go.10xgenomics.com/scRNA-3/optimal-sample-prep)。冷冻保存、固定(详见甲醇固定的演示方案:go.10xgenomics.com/scRNA-3/methanol-fixation),以及从长期保存的样本中分离细胞核(详见细胞核分离的演示方案:go.10xgenomics.com/scRNA-3/nuclei-isolation)这些替代的制备方案也与我们的系统兼容。

B. 样本处理

在分离或组织解离后快速处理样本的能力对维持细胞完整性和保留每个细胞的转录组至关重要。请注意,任何样本操作都有可能对基因表达谱、细胞状态或细胞活力产生不利影响,并在研究中引入偏好性(Van Den Brick S.C. et al, Nat. Met, 2017)

Step3

我的实验需要多少细胞和重复?

A. 细胞数量实验所需的细胞数量取决于样本预期的细胞异质性、样本中的细胞数、细胞亚群预期的最低频率,以及数据分析所需的每种细胞类型的最低数量(详见在线工具:satijalab.org/howmanycells)。如果不清楚样本多样性,那么在低测序深度下测序大量细胞也许是最灵活的选择,有助于获得有代表性的细胞群体比例和有意义的生物学信息。Chromium系统能够以较低的doublet率(0.9%/1000个细胞)回收大约65%的上样细胞。Chromium系统的高通量能够处理高度异质的样本,这些样本或许需要数千个细胞才能分辨出每个亚群。相比之下,该系统的高细胞回收率非常适合细胞数量有限的样本。
B. 测序深度每个实验的测序深度取决于单个细胞中的mRNA总量和这些细胞中mRNA种类的多样性。通常而言,在转录本多样性相同的情况下,表达少量mRNA的细胞比表达大量mRNA的细胞所需的测序深度要低得多。当测序成本或通量受限时,通常需要在测序较多的细胞(宽度)和以更多的reads测序较少的细胞(深度)之间进行权衡。阅读技术指南,了解更多信息 :go.10xgenomics.com/scRNA-3/number-and-depth10x Genomics的单细胞基因表达文库与短读长测序仪兼容。此外,我们的方案利用独特的分子标识符(UMI)在扩增发生之前对每个转录本分子进行编码,从而在考虑到PCR扩增偏好性的前提下生成数字基因表达谱。
C. 重复数量重复数量取决于研究项目、样本类型、以及研究所需的细胞数量。生物学重复仍然是业界一个有争议的问题。在一些研究中,一个样本就已经足够,其中每个细胞代表了一个生物学重复,而不同个体的不同样本则解释了特定生物学过程的差异。在另一些研究中,为了减少小细胞群体随时间发生的生物学变化,混合不同样本中的细胞以覆盖所研究细胞群体的各个方面也许是有好处的。在其他的情况下,可能需要使用一个样本的多个重复,以增加研究中的细胞总数。
D. 批次效应批次效应可能在工作流程的任何阶段引入,主要是后勤方面的限制,导致不同的制备时间、操作人员和处理方案。10x GenomicsChromium系统在各种技术重复中表现出最好的技术稳定性(详见技术指南:go.10xgenomics.com/scRNA-3/technicalreplicates)。在合并多个文库的数据时,我们建议在合并之前平衡各个文库的读取深度(深度归一化),以便减少测序引入的批次效应(详见技术指南 :go.10xgenomics.com/scRNA-3/depthnormalization)。此外,许多计算工具,包括SeuratScranScrone,也能纠正批次效应。

Step4

我该如何分析和可视化我的数据?

A. 处理和分析测序数据在测序之后,您将通过一组分析管道(Cell Ranger)来处理您的原始数据,它们将比对序列、过滤、计数条形码和UMI,生成Feature-Barcode矩阵,并开展聚类和基因表达分析。Cell Ranger能够合并多个实验的输出结果,归一化到相同的测序深度,并重新分析合并后的数据。Cell Ranger pipelineLinux系统上运行,而大多数软件依赖性捆绑在Cell Ranger软件包中(详见系统要求:go.10xgenomics.com/scRNA-3/systemrequirements)。


B. 数据可视化Loupe Cell Browser是一款桌面应用程序,适用于快速、交互式的单细胞数据可视化和分析。为了加速新的标志物基因的探索,您可以鉴定稀有的细胞类型,探索数据中的新型子结构,而不需要事先掌握编程知识(详见在线教程 go.10xgenomics.com/scRNA-3/visualization-tutorial)。

Cell Ranger pipeline生成的输出文件可以通过大部分以RPython语言开发的开源软件包来解释分析。单细胞基因表达分析最常用的一些软件包是SeuratMonocle。如果您具有编程基础,则可通过这两种R语言软件包开展QC检验、二次分析以及对单细胞基因表达数据的探索(详见 github.com/seandavi/awesome-single-cellwww.scrna-tools.org网站所列软件包)。

关于ca88会员登录入口

ca88会员登录入口生物具有多年基因组、转录组和表观组等多组学检测与分析的经验,现推出的10x Genomics单细胞转录组测序可为您提供专业的科研服务及个性化的单细胞信息挖掘,期待成为您单细胞测序分析的优质服务提供商!

欢迎联系我们具体咨询!邮箱:techsupport@geomatejr.com

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